Razvoj multidimenzionalne kromatografije za razdvajanje peptida pomoću automatizirane mikroekstrakcije na čvrstoj fazi

diplomski rad

• Naslov (engleski): Development of multidimensional chromatography for separation of peptides using automated solid-phase microextraction
• Autor: Nika Bilić
• Mentor: Bojan Žunar (mentor)
• Mentor: Mario Cindrić (komentor)
• Mentor: Renata Biba (pomoć pri izradi, neposredni voditelj)
• Član povjerenstva: Renata Teparic (predsjednik povjerenstva)
• Član povjerenstva: Mario Cindrić (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Igor Slivac (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prehrambeno-biotehnološki fakultet; (Zavod za kemiju i biokemiju); (Laboratorij za biokemiju); Zagreb
• Datum i država obrane: 2024-07-18, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: BIOTEHNIČKE ZNANOSTI; Biotehnologija

Sažetak

Multidimenzionalna tekućinska kromatografija (LC) spregnuta sa spektrometrijom masa (MS) ima ključnu ulogu u proteomskom pristupu odozdo-nagore zbog povećanja osjetljivosti metode smanjenja kompleksnosti uzorka. Mikroekstrakcija čvrstom fazom (µSPE) je jednostavna i učinkovita metoda pripreme uzoraka za MS. Cilj ovog rada bio je ispitati ortogonalnost nekonsekutivnog sustava za multidimenzionalno frakcioniranje peptida BSA kako bi se utvrdilo koja kombinacija tehnika pokazuje najveću nezavisnost. Optimizirano je i ispitano frakcioniranje kombinacijom 6 metoda odjeljivanja na µSPE uređaju s pozitivnim pritiskom: i) izmjenjivač kombiniranog načina jake anionske izmjene i izmjene obrnutih faza, ii) jaki kationski i iii) jaki anionski izmjenjivač, iv) hidrofilno-lipofilni izmjenjivač i izmjenjivač obrnutih faza pri v) niskom pH i vi) visokom pH. Šest nastalih frakcija je analizirano LC-MS sustavom, a sirovi podaci su obrađeni alatom za pretragu baza podataka. Rezultati su pokazali da za frakcioniranje peptida BSA najveću ortogonalnost daje kombinacija hidrofilno-lipofilnog izmjenjivača ili jakih ionskih izmjenjivača u prvoj dimenziji te jakih ionskih izmjenjivača u drugoj dimenziji.

Sažetak (engleski)

Multidimensional liquid chromatography (LC) coupled with mass spectrometry (MS) is pivotal in the bottom-up proteomic approach for its enhanced sensitivity through the reduction of peptide complexity. Solid-phase microextraction (µSPE) is a simple and efficient sample preparation method for MS. The aim of this study was to optimize and evaluate the orthogonality of offline multidimensional fractionation methods for BSA peptides to determine the combination of fractionation methods which provides the highest degree of independence, using a positive pressure µSPE platform. The fractionation capabilities of 6 separation methods were examined: i) mixed-mode strong anion-exchange and reversed phase, ii) strong cation-exchange, iii) hydrophilic-lipophilic balance, iv) strong anion-exchange, and v) low pH and vi) high pH reverse phase. Six obtained fractions of each fractionation were analyzed on an LC-MS system, with raw data processed using a protein database search engine. The results showed that for BSA peptides, the highest orthogonality was achieved with a combination of hydrophilic-lipophilic balance or strong ion-exchange chromatography (IEC) in the first dimension and strong IEC in the second dimension.

• Ključne riječi: multidimenzionalnost; mikroekstrakcija na čvrstoj fazi; ortogonalnost; nepokretne faze; spektrometrija masa
• Ključne riječi (engleski): multidimensionality; solid phase microextraction; orthogonality; stationary phase; mass spectrometry
• Jezik: hrvatski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:159:789331
• Studijski program: Naziv: Molekularna biotehnologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra inženjer/inženjerka molekularne biotehnologije (mag. ing. biotechn.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Otvoreni pristup
• Datum i vrijeme pohrane: 2024-08-27 09:23:07