Ekspresija i karakterizacija rekombinantnoga folikul-stimulirajućega hormona (FSH) u CHO staničnoj liniji u mediju bez seruma

disertacija

• Naslov (engleski): Expression and characterization of recombinant follicle-stimulating hormone (FSH) in CHO cell line in serum-free medium
• Autor: Željka Antolović; MBZ: 193234
• Mentor: Vladimir Mrša (mentor)
• Član povjerenstva: Višnja Gaurina-Srček (predsjednik povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prehrambeno-biotehnološki fakultet; Zagreb
• Datum i država obrane: 2012-09-19, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: BIOTEHNIČKE ZNANOSTI; Biotehnologija
• Univerzalna decimalna klasifikacija (UDC): 577 - Biokemija. Molekularna biologija. Biofizika

Sažetak

FSH, član porodice gonadotropnih peptidnih hormona, nastaje u adenohipofizi i ima ključnu ulogu u reprodukciji sisavaca. Humani FSH se danas proizvodi rekombinantnom DNA tehnologijom u kulturi animalnih stanica. Zbog niza problema i rizika vezanih za korištenje seruma u mediju, za biotehnološku proizvodnju terapijskih proteina poželjno je koristiti medij bez seruma odnosno kemijski definirani medij. U ovom radu stanice CHO DG44, koje rastu u suspenziji i kemijski definiranom mediju, transfektirane su zasebnim ekspresijskim vektorima od kojih svaki sadržava gen za jednu od podjedinica humanog FSH. Tijekom uzgoja u selektivnom mediju s metotreksatom i nakon nekoliko ciklusa umnožavanja FSHα i FSHβ gena, dobivene su stanice koje proizvode heterodimer rFSH. Metodom graničnog razrijeđivanja stanica izdvojeni su pojedinačni klonovi. Napravljen je probir klonova s obzirom na ekspresiju rFSH. Odabrani klonovi uzgajani su u suspenziji u kemijski definiranom mediju, a tijekom procesa uzgoja u različitim kultivacijskim sustavima laboratorijskog mjerila praćen je udio živih stanica i specifična brzina rasta, kinetika potrošnje nutritijenata i nastajanja metabolita te proizvodnja eksprimiranog rFSH. Optimiranjem uzgoja dodatkom kemijski definiranih hranjivih smjesa u medij četiri puta je povećan prinos rFSH u odnosu na uzgoj u početnim uvjetima. Dokazano je da se rFSH izlučuje u medij kao cjeloviti heterodimer čiji glikozilacijski profil odgovara referentnom rFSH.

Sažetak (engleski)

FSH, a member of gonadotropin family of peptide hormones, is secreted by the anterior pituitary gland and has a key role in reproduction. FSH can be produced in animal cell expression systems by recombinant DNA technology. In biopharmaceutical production of therapeutic proteins it is preferred to use growth medium without serum. In this work, CHO DG44 cells were cultivated in a chemically-defined medium in suspension and transfected by two separate expression vectors containing FSHα and FSHβ genes to achieve stable expression of recombinant human FSH. After gene amplification process and cloning, the clones producing rFSH were selected. The production of rFSH was increased 4 times by optimization of cell growth in suspension and various cultivation systems. Analysis of metabolites present in media led to define the best ratio among the used chemically-defined feedings. Additionally, their influence on cell growth in suspension and production of rFSH was determined. The rFSH was purified by immuno-affinity chromatography. It was confirmed that the rFSH heterodimer, expressed in CHO DG44 cells and secreted into medium, had the glycosylation pattern of isoformes corresponding to that of the rFSH reference product.

• Ključne riječi: FSH; CHO stanična kultura; stabilna ekspresija; medij bez seruma
• Ključne riječi (engleski): FSH; CHO cell line; stable expression; serum-free media
• Jezik: hrvatski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:159:761874
• Datum promocije: 2012-10-21
• Studijski program: Naziv: Biotehnologija i bioprocesno inženjerstvo; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: poslijediplomski doktorski; Akademski / stručni naziv: doktor/doktorica znanosti (dr.sc.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Pristup korisnicima matične ustanove
• Datum i vrijeme pohrane: 2018-05-16 11:50:14