The impact of sumoylation on the interaction between Nfi-SecPH domain and its interaction partners: VCP/p97 and LIMK2

diplomski rad

• Naslov (francuski): Utjecaj sumoilacije na interakciju između Nf1-SecPH domene i njenih interakcijskih partnera: VCP/p97 i LIMK2
• Autor: Lovro Marjanović
• Mentor: Igor Stuparević (mentor)
• Član povjerenstva: Igor Stuparević (predsjednik povjerenstva)
• Član povjerenstva: Antonio Starčević (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prehrambeno-biotehnološki fakultet; (Zavod za kemiju i biokemiju); (Laboratorij za biokemiju); Zagreb
• Datum i država obrane: 2023-07-03, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: BIOTEHNIČKE ZNANOSTI; Biotehnologija

Sažetak

Neurofibromatosis type I (NF1) is a genetic disease caused by mutations in the NF1 gene, leading to the aberrant function of the tumor-suppressor protein neurofibromin (Nf1). Nf1 regulates Ras activity through its GRD (GAP-related domain) domain and participates in various signaling pathways via its SecPH domain, involved in lipid and protein interactions. Recently, SUMOylation, a rare post-translational modification, has been discovered on Nf1. At the molecular level, SUMOylation can modulate the activity, stability, localization, and interaction pattern of target proteins. Studies on Nf1 SUMOylation have identified a highly conserved and surface-exposed lysine residue (K1731) in the SecPH domain, demonstrating the importance of SecPH SUMOylation in an unidentified function of Nf1. Pathogenic variants of Nf1 with neurofibromatosis have been found to harbor a substitution of this SUMO acceptor and show a different SUMOylation profile. However, the GTPase activity of this Nf1 variant is unaffected, leading to the hypothesis that SUMOylation of Nf1 could regulate its interaction with partners. This study examines the impact of SUMOylation on the interaction between the SecPH domain of Nf1 and its interacting partners, LIMK2, a key kinase in the Rho/ROCK/LIMK2/cofilin pathway, and VCP/p97, versatile AAA (ATPase associated with a variety of cellular activities) protein. Three experimental conditions were employed. First, endogenous SUMOylation was evaluated using wild-type and SUMOylation-deficient (K1731R) Flag-SecPH mutants in HEK293 cells. LIMK2 and its domains were co-transfected. The second condition assessed enhanced SUMOylation by co-transfecting cells with Ubc9 and SUMO2 plasmids. Lastly, the impact of total SUMOylation inhibition was assessed using a SUMOylation inhibitor. Immunoprecipitation assays with Flag beads and subsequent western blot analysis were performed using tag-specific antibodies. Results indicate that SUMOylation does not play a role in the SecPH-VCP interaction. However, for the SecPH-LIMK2 interaction, differential affinities were observed between the SUMOylation-deficient SecPH mutant and LIMK2 in the presence of endogenous SUMOylation. Additionally, the interaction was affected by pathogenic variants in the SecPH domain, indicating the significance of the β-protrusion region in this interaction.

Sažetak (francuski)

La neurofibromatose de type I (NF1) est une maladie génétique causée par des mutations dans le gène NF1, ce qui entraîne une fonction anormale de la protéine suppresseur de tumeur neurofibromine (Nf1). Nf1 régule l'activité de Ras à travers son domaine GRD (GAP-related domain) et participe à diverses voies de signalisation via son domaine SecPH, impliqué dans les interactions lipidiques et protéiques. Récemment, la SUMOylation, une modification post traductionnelle rare, a été découverte sur Nf1. Au niveau moléculaire, la SUMOylation peut moduler l'activité, la stabilité, la localisation et le schéma d'interaction des protéines cibles. Des études sur la SUMOylation de Nf1 ont identifié un résidu lysine hautement conservé et exposé en surface (K1731) dans le domaine SecPH, démontrant l'importance de la SUMOylation de SecPH dans une fonction non identifiée de Nf1. Des variants pathogènes de Nf1 associés à la neurofibromatose ont été trouvés porteurs d'une substitution de cet accepteur SUMO et montrent un profil de SUMOylation différent. Cependant, l'activité GTPase de ce variant Nf1 n'est pas affectée, ce qui conduit à l'hypothèse que la SUMOylation de Nf1 pourrait réguler son interaction avec ses partenaires. Cette étude examine l'impact de la SUMOylation sur l'interaction entre le domaine SecPH de Nf1 et ses partenaires interactifs, LIMK2, une kinase clé dans la voie Rho/ROCK/LIMK2/cofiline, et VCP/p97, une protéine AAA polyvalente (ATPase associée à diverses activités cellulaires). Trois conditions expérimentales ont été utilisées. Tout d'abord, la SUMOylation endogène a été évaluée en utilisant des mutants Flag SecPH de type sauvage et déficients en SUMOylation (K1731R) dans des cellules HEK293. LIMK2 et ses domaines ont été co-transfectés. La deuxième condition a évalué la SUMOylation renforcée en co-transfectant les cellules avec des plasmides Ubc9 et SUMO2. Enfin, l'impact de l'inhibition totale de la SUMOylation a été évalué en utilisant un inhibiteur de SUMOylation. Des tests d'immunoprécipitation avec des billes Flag et une analyse ultérieure par western blot ont été réalisés en utilisant des anticorps spécifiques. Les résultats indiquent que la SUMOylation ne joue pas de rôle dans l'interaction SecPH-VCP. Cependant, pour l'interaction SecPH-LIMK2, des affinités différentielles ont été observées entre le mutant SecPH déficient en SUMOylation et LIMK2 en présence de SUMOylation endogène. De plus, l'interaction est affectée pour des variants pathogènes dans le domaine SecPH, ce qui souligne l'importance de la β-protrusion dans cette interaction.

• Ključne riječi: neurofibromatosis type I; LIMK2; VCP; SUMOylation; K1731; cell signalling
• Ključne riječi (francuski): neurofibromatose de type I; LIMK2; VCP; SUMOylation; K1731; signalisation cellulaire
• Jezik: engleski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:159:134828
• Studijski program: Naziv: Molekularna biotehnologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra inženjer/inženjerka molekularne biotehnologije (mag. ing. biotechn.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Otvoreni pristup
• Datum i vrijeme pohrane: 2024-06-21 09:43:50