Engineering of xylose reductase based on ancestral sequence reconstruction

diplomski rad

• Naslov (hrvatski): Inženjerstvo ksiloza reduktaze temeljeno na rekonstrukciji ancestralnih sekvenci enzima
• Autor: Ema Ćurin
• Mentor: Anita Slavica (mentor)
• Član povjerenstva: Jasna Novak (predsjednik povjerenstva)
• Član povjerenstva: Renata Teparić (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prehrambeno-biotehnološki fakultet; (Zavod za biokemijsko inženjerstvo); (Laboratorij za biokemijsko inženjerstvo, industrijsku mikrobiologiju i tehnologiju piva i slada); Zagreb
• Datum i država obrane: 2025-03-04, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: BIOTEHNIČKE ZNANOSTI; Biotehnologija

Sažetak

Phylogenetic tree was constructed by using 350 extant xylose reductases and ancestral sequence reconstruction, and for 15 of them kinetic parameters for D-xylose as substrate and NADH as cofactor were selected. Based on these criterion, five ancestors, N0, N5, N15, N17 and N22, were chosen for xylose reductase engineering. All five His-tagged proteins were expressed in E. coli BL21(DE3) and purified. N15 and N22 showed the desired substrate selectivity with NADH as a cofactor. D-xylose was... Više converted faster by N17 when NADH rather than NADPH was used as the cofactor. Among the five ancestors, N15 showed the highest thermostability (Tm = 74.5°C). When compared to specific extant enzymes, N15, N17 and N22 exhibit lower specific activity and catalytic efficiency for D-xylose and NADH. Although N17 holds high promises because of its NADH over NADPH preference, these three ancestors at this stage are to be improved for industrial xylitol production. Sakrij dio sažetka

Sažetak (hrvatski)

Rekonstrukcijom 350 sekvenci ksiloza reduktaze formirano je filogenetsko stablo i za 15 enzima odabrani su kinetički parametri za supstrat (D-ksiloza) i kofaktor (NADH). Temeljem ovih kriterija odabrano je pet ancestora, N0, N5, N15, N17 i N22, za inženjerstvo ksiloza reduktaze. Nakon što je pet proteina s His-tagom eksprimirano u E. coli BL21(DE3), slijedilo je njihovo pročišćavanje. Enzimi N15 i N22 su pokazali selektivnost prema D-ksilozi z NADH kao kofaktor. N17 brže konvertira... Više D-ksilozu uz NADH nego uz NADPH kao kofaktor. Između pet ancestora, N15 ima najveću termostabilnost (Tm = 74.5°C). Ukoliko se usporede s postojećim enzimima, N15, N17 i N22 iskazuju nižu specifičnu aktivnost i katalitičku učinkovitost za D-ksilozu i NADH. Iako kataliza pomoću N17 ksiloza reduktaze ima potencijal primjene zbog afiniteta prema NADH, potrebna su daljnja istraživanja tri ancestora s ciljem optimiranja prije njihove eventualne primjene u industrijskoj proizvodnji ksilitola. Sakrij dio sažetka

• Ključne riječi: xylose reductase; ancestral sequence reconstruction; NADH; D-xylose
• Ključne riječi (hrvatski): ksiloza reduktaza; rekonstrukcija ancestralnih sekvenci; NADH; D-ksiloza
• Jezik: engleski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:159:239011
• Studijski program: Naziv: Molekularna biotehnologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra inženjer/inženjerka molekularne biotehnologije (mag. ing. biotechn.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Otvoreni pristup
• Datum i vrijeme pohrane: 2025-03-07 09:37:46