Pročišćavanje i djelomična karakterizacija rekombinantne ljudske dipeptidil-peptidaze III

diplomski rad

• Naslov (engleski): Purification and partial characterization of recombinant human dipeptidyl-peptidase III
• Autor: Marina Andrejević
• Mentor: Vladimir Mrša (mentor)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prehrambeno-biotehnološki fakultet; (Zavod za kemiju i biokemiju); (Laboratorij za biokemiju); Zagreb
• Datum i država obrane: 2010-06-07, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: BIOTEHNIČKE ZNANOSTI; Biotehnologija

Sažetak

Ljudska dipeptidil-peptidaza III (DPP III), član porodice metalopeptidaza M49, enzim je s ulogom u intracelularnom katabolizmu proteina. S ciljem istraživanja uloge evolucijski sačuvanog ostatka Asn406, u ovom diplomskom radu su sintetizirani divlji tip DPP III i njen mutirani oblik N406S prekomjernom ekspresijom u bakteriji Escherichia coli transformiranoj plazmidom koji je sadržavao cDNA za ljudsku DPP III s privjeskom od 6 His. Nakon pročišćavanja afinitetnom kromatografijom, rekombinantnim proteinima je određena molekulska masa (81 kDa) SDS-elektroforezom, specifična aktivnost za hidrolizu kromogenog supstrata Arg-Arg-2-naftilamida (37,81 jmg-1 za divlji tip, 14,52 jmg-1 za mutant N406S), optimalni pH (8,6) i temperatura djelovanja (37 °C), te temperaturna stabilnost (do 37 °C za divlji tip, do 30 °C za N406S). Ustanovljena je inhibicija obaju enzimskih oblika kelatorima metala i sulfhidrilnim reagensom p-hidroksimerkuribenzoatom, te selektivnost za supstrat Arg-Arg-2-naftilamid. Rezultati ukazuju na važnost Asn406 za postizanje pune katalitičke aktivnosti i za termičku stabilnost ljudske DPP III.

Sažetak (engleski)

Human dipeptidyl-peptidase III (DPP III) is a member of the metallopeptidase family M49 with implied role in intracellular protein catabolism. To investigate the role of highly conserved Asn406, herein the wild-type DPP III and mutant N406S were overexpressed in Escherichia coli transformed with plasmid containing the cDNA encoding His6-tagged human DPP III. Recombinant proteins were purified by affinity chromatography, and their molecular mass (81 kDa) was determined by SDS-PAGE, as well as the specific activity for hydrolysis of chromogenic substrate Arg- Arg-2-naphthylamide (37.81 Umg-1, wild-type; 14.52 Umg-1, mutant N406S), pH and temperature optima (at 8.6, respectively 37 °C), and thermal stability (up to 37 °C for the wild-type, up to 30 °C for N406S). Both enzymes were inhibited by metallochelators and p-hydroxymercuri-benzoate, and showed selectivity for Arg-Arg-2-naphthylamide. The results suggest that Asn406 could be important for acquirement of full catalytic activity, and may contribute to human DPP III thermal stability.

• Ključne riječi: dipeptidil-peptidaza III; porodica M49; metalopeptidaza
• Ključne riječi (engleski): dipeptidyl-peptidase III; M49 family; metallopeptidase
• Jezik: hrvatski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:159:201266
• Studijski program: Naziv: Biotehnologija; smjerovi: Biokemijsko inženjerstvo; Smjer: Biokemijsko inženjerstvo; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: dodiplomski; Akademski / stručni naziv: diplomirani inženjer biotehnologije; smjer biokemijsko inženjerstvo (dipl. ing. bioteh.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Pristup korisnicima matične ustanove
• Datum i vrijeme pohrane: 2017-08-29 09:32:48