Identification and characterization of cellodextrin phosphorylases for their application in synthesis of reducing-end thiol-modified cello-oligosaccharides

diplomski rad

• Naslov (hrvatski): Identifikacija i karakterizacija celodekstrin fosforilaza za njihovu primjenu u sintezi tiol-modificiranih celo-oligosaharida
• Autor: Mislav Sušac
• Mentor: Anita Slavica (mentor)
• Član povjerenstva: Renata Teparic (predsjednik povjerenstva)
• Član povjerenstva: Blaženka Kos (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prehrambeno-biotehnološki fakultet; (Zavod za biokemijsko inženjerstvo); (Laboratorij za biokemijsko inženjerstvo, industrijsku mikrobiologiju i tehnologiju piva i slada); Zagreb
• Datum i država obrane: 2023-03-15, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: BIOTEHNIČKE ZNANOSTI; Biotehnologija

Sažetak

Four promising cellodextrin phosphorylases (CdPs) were identified as potential candidates for synthesis of reducing-end thiol-modified cello-oligosaccharides (retmco). The enzymes catalyzed two reactions - synthesis of the retmco and hydrolysis of glucosyl donor. CdP from Spirochetae thermophila (StCdP) proved to be the best candidate (the highest synthesis and the lowest hydrolase activity). Further improvement was achieved by the dual-enzyme cascade reaction, performed by cellobiose phosphorylase from Clostridium udae (CuCbP) and StCdP. The purity of synthesized 1-thio-cello-oligosaccharides >95% was confirmed with 1H-NMR, and average degree of polymerization was estimated to be 9.3. CdPs with low hydrolase activity have tyrosine in catalytic loop adjacent to the active site, while CdPs with high hydrolase activity have cysteine in this specific position, as confirmed by three single-site mutants. Additional improvement in the synthesis of the retmco was attained by the next dual-enzyme cascade reaction, performed by CuCbP and CdP from Clostridium cellulose mutant C626T.

Sažetak (hrvatski)

Identificirane su četiri celodekstrin fosforilaze (CdPs) kao potencijalni kandidati za sintezu tiol-modificiranih celo-oligosaharida (retmco). Ovi enzimi kataliziraju reakciju u dva smjera - sintezu retmco i hidrolizu molekule donora glukozilne podjedinice. Ponajbolji kandidat (koji je imao najvišu aktivnost sintetaze i najnižu hidrolaznu aktivnost) je bila CdP iz Spirochetae thermophila (StCdP). Daljnje poboljšanje sinteze retmco postignuto je primjenom kaskadne reakcije s dva enzima - celobioza fosforilazom iz Clostridium udae (CuCbP) i StCdP. Čistoća sintetiziranog 1-tio-celo-oligosaharida iznad 95 % je potvrđena 1H-NMR analizom i prosječni stupanj polimerizacije dobivenog 1-tio-celooligosaharida procijenjen je na 9,3. CdPs sa niskom hidrolaznom aktivnosti imaju tirozin u katalitičkoj omči blizu aktivnog mjesta enzima, dok CdPs sa visokom hidrolaznom aktivnosti imaju cistein na ovoj specifičnoj poziciji, kao što je potvrđeno s tri točkaste mutacije. Daljnje poboljšanje sinteze retmco realizirano je primjenom kaskadne reakcije s dva enzima - CuCbP i mutanta C626T CdP iz Clostridium cellulose.

• Ključne riječi: cellodextrin phosphorylases; reducing-end thiol-modified cello-oligosaccharides; cellulose; dual-enzyme cascade reaction
• Ključne riječi (hrvatski): celodekstrin fosforilaze; tiol-modificirani celo-oligosaharidi; celuloza; kaskadna reakcija s dva enzima
• Jezik: engleski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:159:241474
• Studijski program: Naziv: Molekularna biotehnologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra inženjer/inženjerka molekularne biotehnologije (mag. ing. biotechn.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Zatvoreni pristup
• Datum i vrijeme pohrane: 2024-06-27 10:16:58