Razvoj tranzijentnoj transformacijske metode u topoli

diplomski rad

• Naslov (engleski): Development of a transient transformation method in poplar
• Autor: Josipa Atlija
• Mentor: Vladimir Mrša (mentor)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prehrambeno-biotehnološki fakultet; (Zavod za kemiju i biokemiju); (Laboratorij za biokemiju); Zagreb
• Datum i država obrane: 2015-07-02, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: BIOTEHNIČKE ZNANOSTI; Biotehnologija

Sažetak

The objective of this study was to develop a simple, rapid, economical and efficient Agrobacterium -mediated vacuum infiltration for transient expression of a T-DNA construct in poplar leaves. In addition, we aimed at preparing a suitable genetic construct for poplar protoplast transformation. The work was designed as a part of the large national French project, named GENIUS (Genome Engineering Improvement for Useful plants of a Sustainable agriculture). First, we optimized the agroinfiltration conditions by testing different Silwet L-77 concentrations, vacuum pressures and the effect of 50 μg/ml Cefotaxime. Agrobacterium tumefaciens strain C58 (pMP90) (I203) carrying a binary vector harboring GUS and EGFP reporter genes on its T-DNA was used to follow the transformation efficiency. The Silwet L-77 concentration was positively correlated with the transformation efficiency and the best results were achieved with 0.003 % Silwet L-77 concentration. Changing vacuum conditions didn’t have any considerable effect while putting agroinfiltrated leaves first without Cefotaxime and after transferring on Cefotaxime resulted with a significant increase in transformation rates. We demonstrated that this assay can be used as a fast construct- testing methodology and in quick functional analysis of protein subcellular localization. For the other part of the experiments we worked on preparing a genetic construct for poplar protoplast transformation that would allow the selection of transformed antibiotic-resistant protoplasts before regeneration of transgenic plantlets. The construction strategy was to amplify the hygromycin resistance gene (hpt) by PCR using primers that contain Sal I restriction sites, clone it in an intermediate vector, retrieve the gene fragment by Sal I digestion and clone it in pre-existing plasmid pOMEGA GUS-GFP at an unique Sal I restriction site. Although we were not able to go till the end of this cloning strategy, we produced the intermediate vector. As the hpt insert is large and difficult to clone, increasing the insert/recipient ratio is probably an important parameter to have a successful ligation.

Sažetak (francuski)

L'objectif de cette étude était de développer une méthode simple, rapide, économique et efficace d'agroinfiltration de feuilles de peuplier permettant l'expression transitoire de gènes d'intéret. Par ailleurs, nous avons cherché à préparer une construction génétique appropriée pour la transformation de protoplastes chez le peuplier. Ce travail s'intègre à un projet français plus large dédié à la transformation génétique de plantes d'intéret agronomique, intitulé GENIUS (Genome Engineering Improvement for Useful plants of a Sustainable agriculture). En premier lieu, nous avons optimisé les conditions d’agroinfiltration sous vide en testant différentes concentrations de Silwet L-77, différentes valeurs de pression ainsi que l’effet du cefotaxime. La souche d’ Agrobacterium tumefaciens C58 (pM90) (I203) ayant intégré un vecteur binaire portant les gènes rapporteurs GUS et EGFP sur son T-DNA a été utilisée pour suivre l’efficacité de transformation. La concentration en Silwet L-77 est apparue positivement corrélée à l’efficacité de transformation et les meilleurs résultats ont été obtenus avec une concentration de 0.003%. Les conditions de vide n’ont en revanche pas eu d’effet significatif, alors que laisser temporairement les feuilles agroinfiltrées sur des boites de Petri sans Cefotaxime avant de les transférer sur Cefotaxime a conduit à une augmentation significative des taux de transformation. Cette méthode peut être utilisée pour une évaluation rapide de vecteurs binaires de transformation génétique, ainsi que pour la localisation subcellulaire de protéines d’intéret. Une autre partie des expérimentations a consisté en la préparation d’un vecteur pour la transformation de protoplastes de peuplierpermettant la sélection de protoplastes transformés résistants aux antibiotiques avant la régénération de plantules transgéniques. La stratégie de construction était d’amplifier le gène de résistance à l’hygromycine (hpt) par PCR avec des amorces contenant des sites de restriction Sal I, de le cloner dans un vecteur intermédiaire, de récupérer le fragment de gène par digestion Sal I et de le cloner dans un plasmide pOMEGA GUS-GFP pré-existant dans un site de restriction Sal I unique. Bien que cette stratégie de clonage n’ait pas abouti ici, nous avons pu produire le vecteur intermédiaire. L’insert hpt étant grand et difficile à cloner, augmenter le ratio insert/plasmide est certainement un paramètre important pour réussir la ligation.

• Ključne riječi: Poplar; transient expression; agroinfiltration; vacuum infiltration
• Ključne riječi (francuski): Peuplier; expression transitoire; agroinfiltration; infiltration sous-vide
• Jezik: engleski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:159:757287
• Studijski program: Naziv: Molekularna biotehnologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra inženjer/inženjerka molekularne biotehnologije (mag. ing. biotechn.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Pristup korisnicima matične ustanove
• Datum i vrijeme pohrane: 2017-05-02 10:05:57