Poboljšanje postupka transformacije kvasca Scheffersomyces stipitis elektroporacijom

diplomski rad

• Naslov (engleski): The improvement of the transformation procedure by electroporation for the yeast Scheffersomyces stipitis
• Autor: Lada Ćurković
• Mentor: Anamarija Štafa (mentor)
• Član povjerenstva: Ivan Krešimir Svetec (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prehrambeno-biotehnološki fakultet; (Zavod za biokemijsko inženjerstvo); (Laboratorij za biologiju i genetiku mikroorganizama); Zagreb
• Datum i država obrane: 2021-12-03, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: BIOTEHNIČKE ZNANOSTI; Biotehnologija

Sažetak

Nekonvencionalni kvasac Scheffersomyces stipitis, izoliran je iz trulećeg drva i larvi insekata koji nastanjuju drvo. S. stipitis ima jednu od najviših sposobnosti izravne fermentacije ksiloze u etanol što je posebno zanimljivo pri proizvodnji bioetanola iz lignoceluloznih sirovina. Ovaj kvasac je prototrof, rezistentan je na antibiotike koji se često koriste kao selektivni biljezi pri transformaciji, nisu razvijeni visokoefikasni postupci za transformaciju te mu efikasnost transformacije iznosi 1∙10³ transformanata μgˉ¹. Cilj ovog rada bio je modificirati protokol za elektroporaciju kako bi se postigla viša efikasnost transformacije te odrediti uspješnost genskog ciljanja mehanizmom rekombinacije krajevi-van. Modificirani protokol za elektroporaciju omogućio je postizanje efikasnosti transformacije više od 1∙10⁵ transformanata μgˉ¹. Uspješnost genskog ciljanja, u sustavu u kojem se istraživala zamjena gena SsURA3 genom koji nosi rezistenciju na higromicin, koji se nalazi na disrupcijskoj kazeti, procijenjena je na manje od 0,2 % jer prilikom transformacije nije nastao nijedan transformant željenog fenotipa. Dodatno, istražena je i mogućnost primjene CRISPR/Cas sustava kako bi se povećala uspješnosti genskog ciljanju u kvascu S.stipitis.

Sažetak (engleski)

Scheffersomyces stipitis is a non-conventional yeast known for its capacity to ferment xylose and convert it to ethanol which is useful in the production of bioethanol from lignocellulosic materials. S. stipitis is isolated from decaying wood and larvae of wood-inhabiting insects. This yeast species is prototroph and resistant to antibiotics frequently used as selection markers for transformation. Furthermore, there are no highly efficient transformation protocols resulting in transformation efficiency around 1∙10³ transformants μgˉ¹. The aim of this research was to determine the electroporation parameters that increase the efficiency of transformation and to determine the percentage of gene targeting by ends-out recombination. Modified electroporation protocol resulted in transformation efficiencies higher than 1∙10⁵ transformants μgˉ¹. The expected result of gene targeting by ends-out recombination was the replacement of SsURA3 gene with a hygromycin resistance gene on the disruption cassette and it was estimated to be lower than 0.2 % since none of the transformants showed the desired phenotype. Additionally, the use of CRISPR/Cas system for the improvement of gene targeting efficiency in S.stipitis was analyzed.

• Ključne riječi: kvasac Scheffersomyces stipitis; transformacija; elektroporacija; gensko ciljanje; sustav CRISPR/Cas
• Ključne riječi (engleski): yeast Scheffersomyces stipits; transformation; electroporation; gene targeting; CRISPR/Cas system
• Jezik: hrvatski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:159:375037
• Studijski program: Naziv: Molekularna biotehnologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra inženjer/inženjerka molekularne biotehnologije (mag. ing. biotechn.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Otvoreni pristup
• Datum i vrijeme pohrane: 2021-12-07 12:49:20