Development of a fast, robust and sensitive spectrophotometric assay for measuring hydroxycinnamic acid decarboxylation reactions

diplomski rad

• Naslov (hrvatski): Razvoj brze, robusne i osjetljive spektrofotometrijske metode za mjerenje reakcija dekarboksilacija hidroksicimetnih kiselina
• Autor: Mirna Larva
• Mentor: Anita Slavica (mentor)
• Član povjerenstva: Renata Teparic (predsjednik povjerenstva)
• Član povjerenstva: Blaženka Kos (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prehrambeno-biotehnološki fakultet; (Zavod za biokemijsko inženjerstvo); (Laboratorij za biokemijsko inženjerstvo, industrijsku mikrobiologiju i tehnologiju piva i slada); Zagreb
• Datum i država obrane: 2023-05-11, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: BIOTEHNIČKE ZNANOSTI; Biotehnologija

Sažetak

Biocatalytic decarboxylation of bio-based hydroxycinnamic acids yields p-hydroxystyrene derivates, which are important precursors of antioxidants, epoxy-coatings, adhesives and other polymeric materials. Bacillus subtilis phenolic acid decarboxylase (BsPAD) is a cofactor-independent enzyme that catalyses the cleavage of carbon dioxide from hydroxycinnamic acids such as p-coumaric, caffeic, ferulic and sinapic acid with high catalytic efficiency. Current methods to kinetically characterise the decarboxylation reactions rely on HPLC, MS, GC or NMR, which require extensive sample work-up while measuring only endpoint concentrations. In this work, we use a fast, robust and sensitive spectrophotometric assay that allows following decarboxylation reactions in real-time while avoiding product extraction. Absorption spectra of the pure reaction products were recorded after verifying the completeness of the reactions by TLC and NMR analyses. An optimized assay procedure was used to measure the kinetic constants (KM and Vmax values) of BsPAD for three substrates, which indicates the broad applicability of the assay.

Sažetak (hrvatski)

Biokatalitičkom dekarboksilacijom prirodnih hidroksicimetnih kiselina dobiju se derivati p-hidroksistirena, koji su važni prekursori u proizvodnji antioksidansa, epoksi premaza, adheziva i drugih polimernih materijala. Dekarboksilaza fenolnih kiselina iz bakterije Bacillus subtilis (BsPAD) je enzim neovisan o kofaktoru, koji katalizira izdvajanje ugljičnog dioksida iz p-hidroksicimetnih kiselina poput p kumarinske, kofeinske, ferulinske i sinapinske kiseline uz visoku katalitičku učinkovitost. Metode koje se koriste za kinetičku karakterizaciju reakcija dekarboksilacije se temelje na korištenju HPLC, MS, GC ili NMR, i zahtijevaju opsežnu pripremu uzoraka, a njima se određuje samo krajnja koncentracija produkata ovih reakcija. U ovom diplomskom radu razvijena je brza, robusna i osjetljiva spektrofotometrijska metoda kojom se reakcija dekarboksilacije prati u realnom vremenu i kod koje nije potrebna ekstrakcija dobivenih produkata. Apsorpcijski spektri produkata snimljeni su nakon potvrde o kompletnoj dekarboksilaciji supstrata i to dvjema metodama - TLC i NMR. Optimizirana metoda korištena je za određivanje kinetičkih konstanti (KM i Vmax) za tri supstrata BsPAD, što ukazuje na široku primjenu ove razvijene metode.

• Ključne riječi: p-hydroxycinnamic acids; phenolic acid decarboxylase; UV-VIS spectrophotometric assay
• Ključne riječi (hrvatski): p-hidroksicimetne kiseline; dekarboksilaza fenolne kiseline; UV-VIS
• Jezik: engleski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:159:342678
• Studijski program: Naziv: Molekularna biotehnologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra inženjer/inženjerka molekularne biotehnologije (mag. ing. biotechn.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Otvoreni pristup
• Datum i vrijeme pohrane: 2024-07-09 10:07:32